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      單克隆抗體制備
      目錄號:MY-7/8/9 規格:詢價

          單克隆抗體技術的基本原理 要制備單克隆抗體需先獲得能合成專一性抗體的單克隆B淋巴細胞,但這種B淋巴細胞不能在體外生長。而實驗發現骨髓瘤細胞可在體外生長繁殖,應用細胞雜交技術使骨髓瘤細胞與免疫的淋巴細胞二者合二為一,得到雜種的骨髓瘤細胞。這種雜種細胞繼承兩種親代細胞的特性,它既具有B淋巴細胞合成專一抗體的特性,也有骨髓瘤細胞能在體外培養增殖永存的特性,用這種來源于單個融合細胞培養增殖的細胞群,可制備抗一種抗原決定簇的特異單克隆抗體。

       

         

      技術路線:


       

       

       


      單克隆抗體(McAb)制備注意事項

       () 免疫動物的選擇用于免疫的動物,應選擇與親本骨髓瘤細胞同一品系的動物,因為免疫動物品系和骨髓瘤細胞種系越遠,融合的雜交瘤細胞越易發生免疫排斥反應,越不穩定。目前使用的瘤細胞系,仍限于小鼠和大鼠的骨髓瘤細胞系,其中多來源于純系BALB/c小鼠,所以要選擇該系小鼠用作免疫動物,一般認為,為了減少盲目性,融合前,應測定免疫小鼠的抗體反應性,如果呈陽性,可供融合用,那些對特定抗原不產生血清抗體的小鼠,得不到特異的雜交瘤細胞。一般選擇812周齡,重約20g,健康無病的純系小鼠,雌雄均可應用。

       () 免疫方案

      1 抗原免疫用的抗原盡量設法提高其純度,并保存其活性。同樣濃度的抗原,若含有較多的雜質,會明顯影響抗體的產生,并為雜交瘤細胞分泌抗體的篩選帶來麻煩,獲得所需的分泌特異抗體的雜交瘤細胞的機率也低。

      2 免疫小鼠一次免疫務必同時免疫幾只小鼠,以免小鼠中途死亡。每次注入抗原后,次日,小鼠會出現全身反應,體溫升高、盜汗、聳毛等,此時對室溫和飼養均需注意,以防小鼠死亡。在融合前末次靜注或腹腔注射時,謹防速發型過敏反應發生,而導致小鼠死亡。

      3 不同抗原的免疫方法可溶性抗原,在初次免疫用明礬沉淀抗原100μg2×109滅活百日咳桿菌混合皮下注射,間隔46周,用鹽水抗原100200μg加強免疫,3天后取脾作融合;細胞抗原免疫,用2×107個細胞注入小鼠腹腔,間隔23周,再重復一次,3周后用同樣數量細胞注入小鼠腹腔,3天后取脾作融合。除上述常規免疫方法外,近年來還建立了脾內免疫法及體外細胞免疫法。脾內免疫是將抗原直接注入小鼠的脾臟,具有抗原用量小及免疫周期短的優點;體外細胞免疫,是將抗原加入于體外培養的淋巴細胞中,使之形成免疫細胞。

      () 融合劑PEG對細胞有毒性,一般采用分析純規格。濃度越高,對細胞

      的毒性越大。以40%50%的濃度為宜,pH值以8082促融率最高。PEG對細胞的毒性,還隨分子量增大而加大,分子量10004000之間,效果較好,不同牌號的PEG甚至同一廠家不同批次的產品其毒性及促融率也不一樣,應預先進行試驗。

      () 操作中的污染污染是雜交瘤技術中最常遇到的問題,它往往可使一個即將建株的細胞毀于一旦。所以對所用試劑、器材、環境要根據其要求進行徹底的消毒滅菌。要嚴格無菌操作。發現污染及時處理,避免污染擴大,如果一旦發現某一培養板或培養瓶污染時,要及早廢棄,一般的處理方法不能有效地控制污染的擴散。如有價值的陽性株被污染時,要設法挽救,可將孔壁上細胞吹打下來,配置于05ml生理鹽水中,注射于78天前已腹腔注射石蠟油或降植烷的同系小鼠腹腔內,經過小鼠腹腔內培養,微生物可被腹腔內的巨噬細胞吞噬掉。取出的陽性細胞,繼續用培養瓶傳代培養。

      () 融合后的克隆株不生長有時遇到融合的細胞不生長或開始的頭幾天生長,以后細胞逐漸萎縮,甚至在HAT培養基中死去。這種現象的原因很多,如培養液偏堿,影響細胞發育;HAT培養基中的A過多,對細胞毒性大;HT含量不足,不能為融合細胞提供足夠的營養;培養箱內CO2不足,濕度不夠;另外瘤細胞株的好壞也是影響融合成敗的關鍵因素,所以一定要選用生長良好的瘤細胞供融合用。如發現克隆不生長或生長緩慢時,除檢查上述因素并予以糾正外,還應向此孔內添加小鼠飼養細胞,一般其狀況能得以改善。

      () 用液氮凍存的脾細胞進行細胞融合問題用這種方法保存免疫的脾細胞可隨用隨取,而且簡單易行,融合率可達94%~100%,抗體陽性率達14%~36%。但因脾細胞不能在體外培養,應用一般方法保存易存死亡,所以掌握脾細胞的凍存技術,對于McAb的制備至關重要。

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      參考資料

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      京公網安備 11011402011307號

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